Marcadores Baseados em Reação da Polimerase em Cadeia - PCR

     A tecnologia da PCR foi concebida em meados da década de 80 (Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1985). Desde então esta tecnologia causou uma revolução na biologia, na pesquisa visando o entendimento de processos biológicos fundamentais como nas áreas de melhoramento genético de plantas e animais domésticos, uma vez que esta técnica possibilitou a geração de grandes quantidades de DNA de segmentos específicos, podendo ser facilmente detectado a olho nu em gel de eletroforese através de corantes específicos.

     PCR é uma técnica poderosa, que envolve a síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA polimerase. Sua reação baseia-se no anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita simples) utilizados como indicadores (“primers”) que delimitam a sequência de DNA de fita dupla alvo da amplificação.

     A PCR ocorre em vários ciclos, onde, em cada um deles, a cadeia específica teoricamente dobra de tamanho. Atenção: a frase "reação de PCR" é redundante, significa reação de reação em cadeia da polimerase! Abaixo está representado um ciclo de uma PCR, onde a polimerase do DNA é uma esfera verde, a cadeia "antiga" é azul, um primer é azul claro e o outro é verde, os nucleotídeos são vermelhos, assim como a cadeia sintetizada no presente ciclo:

    Um ciclo de PCR envolve três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. A fita dupla do DNA alvo é desnaturada através da elevação da temperatura para 92°C a 95°C. Na etapa de anelamento, a temperatura é rapidamente reduzida para 35°C a 60°C, dependendo do tamanho e sequência do primer utilizado, permitindo a hibridização DNA-DNA de cada primer com as sequências complementares que flanqueiam a região alvo. Em seguida, a temperatura é elevada para 72°C para que a enzima DNA polimerase realize a extensão a partir de cada terminal 3’ dos primers. Esta extensão envolve a adição de nucleotídeos utilizando como molde a sequência-alvo, de maneira que uma cópia desta sequência é feita no processo. Este ciclo é repetido por algumas dezenas de vezes. Uma vez que a quantidade de DNA da sequência alvo dobra a cada ciclo, a amplificação segue uma progressão geométrica de maneira que, depois de apenas 20 ciclos, é produzido mais de um milhão de vezes a quantidade inicial de sequência alvo. Esta escala de amplificação permite iniciar com quantidades mínimas de DNA (da ordem de picogramas ou nanogramas) e terminar a reação com grandes quantidades de DNA de uma sequência específica de interesse.

    Porém, a construção de primers para amplificação via PCR depende do conhecimento prévio das sequências de nucleotídeos que flanqueiam a sequência de DNA de interesse. Para conhecer estas sequências é necessária a clonagem e sequenciamento da região. Em vista disso, com exceção de alguns genes de sequência conhecida, a PCR apresentou de início, um uso limitado como técnica para a obtenção de marcadores moleculares.