Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso - RAPD

     O grande avanço na área de marcadores moleculares baseados em PCR ocorreu em 1990, com a idéia de utilizar primers mais curtos e de sequência arbitrária para dirigir a reação de amplificação, eliminando assim a necessidade do conhecimento prévio de sequência. A técnica foi desenvolvida por dois grupos nos Estados Unidos (Williams et al., 1990). Foi descrito no trabalho, a técnica no contexto da análise Mendeliana, demonstrando a identificação de marcadores genéticos para melhoramento. Além de facilitar e acelerar os estudos que já ocorriam com as espécies tradicionais (ex: milho, tomate, arroz) a tecnologia RAPD permitiu a realização de estudos em espécies anteriormente não contempladas. As aplicações incluem:

     (1) Obtenção de “fingerprints” (impressões digitais) genômicos de indivíduos, variedades e populações;

     (2) Análise da estrutura e diversidade genética em populações naturais, populações de melhoramento e bancos de germoplasma;

     (3) Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre diferentes espécies;

     (4) Construção de mapas genéticos de alta cobertura genômica e a localização de genes de interesse econômico.

     Base genética dos marcadores RAPD: É basicamente uma variação do protocolo de PCR, com duas características distintas:

     •       Utiliza um primer único ao invés de um par de primers;

     •       O primer único tem sequência arbitrária, e portanto sua sequência alvo é desconhecida.

    Para que haja amplificação de um fragmento RAPD no genoma, duas sequências de DNA complementares ao primer arbitrário devem estar suficientemente adjacentes (< 4000 pares de bases) e em orientação oposta, de maneira a permitir a amplificação exponencial de um segmento de DNA pela DNA polimerase. Em função da grande quantidade de DNA produzido, este segmento pode ser visualizado na forma de banda num gel de eletroforese. Cada primer arbitrário dirige a síntese de vários segmentos de DNA simultaneamente em diversos pontos do genoma, resultando em várias bandas no gel.

     Dados experimentais de mapeamento genético em diversas espécies indicam que os locos de marcadores RAPD estão distribuídos ao acaso ao longo do genoma, sem evidências de agrupamento de marcadores em regiões específicas. As sequências internas dos segmentos amplificados pertencem a todas as classes de abundância de DNA no genoma, desde sequências de cópia única até altamente repetitivas.

     A competitividade de um sítio de amplificação arbitrária é determinada pela homologia com o primer utilizado. Claramente, segmentos RAPD são amplificados mesmo que a homologia entre os sítios de iniciação e o primer não seja perfeita. O pareamento perfeito na extremidade 3’ do primer, a partir da qual a polimerização inicia, parece ser mais crítico que o pareamento na extremidade 5’. Algum nível de não homologia é permitido, o que varia com a composição de bases. Pareamento CG são mais estáveis que AT, o que afeta diretamente o tempo de residência do primer no sítio de iniciação da amplificação. Se este tempo for muito curto, a estabilização do pareamento do primer com o sítio de iniciação no DNA molde será prejudicado. Como resultado, o segmento poderá não ser amplificado, gerando em uma banda fraca no gel.

          Uma característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominância neste caso não se refere ao conceito clássico de interação gênica entre alelos, e sim do ponto de vista da interpretação relativa entre genótipo e fenótipo de um indivíduo. Ao se observar uma banda RAPD no gel, não é possível distinguir se aquele segmento se originou a partir de uma ou duas cópias da sequência amplificada. A técnica RAPD detecta apenas um alelo em cada loco. A ausência de banda representa o conjunto de todos os outros alelos daquele loco que não podem ser amplificados. Embora as grandes maiorias dos marcadores RAPD possuam um comportamento “dominante”, existe a possibilidade de se amplificar marcadores co-dominantes, ou seja, amplificar ambos os alelos de um loco.

     Vantagens e limitações dos marcadores RAPD: Além das vantagens já mencionadas, a técnica de RAPD se baseia na amplificação do DNA, o que resulta em várias vantagens práticas, que podem ser resumidas em simplicidade e rapidez. A obtenção de dados é pelo menos duas ordens de magnitude mais rápida que a técnica de RFLP, que é baseada na hibridização do DNA. Por não utilizar sondas, é eliminada a necessidade de isótopos radioativos ou marcação não radioativa. Outra grande vantagem é a quantidade mínima de DNA necessária para a análise genotípica de um indivíduo (da ordem de dezenas de nanogramas). Permite ainda, gerar uma grande quantidade de polimorfismo de segmentos de DNA, distribuídos por todo o genoma do organismo, oferecendo a possibilidade de amostrar regiões de DNA repetitivo, uma vez que os primers utilizados pata a detecção de variação ao nível de DNA são arbitrários, ao contrário das sondas RFLP que são pré-selecionadas para regiões de cópia única. Esta tecnologia também é adequada para a construção de mapas genéticos ao nível intra-específico. RAPD reúne, portanto, a simplicidade da visualização direta dos marcadores de DNA. O uso desta, não requer experiência aprofundada em biologia molecular e nem tampouco instalações sofisticadas de laboratório. É uma tecnologia bastante acessível.

     No entanto, a principal limitação dos marcadores RAPD é o baixo conteúdo de informação genética por loco. Apenas um alelo é detectado, o segmento que é amplificado, enquanto que as demais variações alélicas são classificadas conjuntamente como um alelo nulo. Genótipos heterozigotos não podem ser diretamente discriminados dos homozigotos por RAPD, esta limitação é comumente descrita como “dominância” dos marcadores. Outra limitação é o desconhecimento prévio da base genética das bandas RAPD. Uma banda RAPD observada no gel só pode ser considerada um marcador de comportamento Mendeliano depois de verificada sua segregação de parentais para descendentes.