Isoenzimas
O termo isoenzimas define um grupo de múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre em uma espécie, como resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas (Moss, 1982). O princípio básico da técnica reside no uso de eletroforese em geral de amido (Smithies, 1955) e na visualização do produto enzimático por métodos histoquímicos (Hunter & Markert, 1957). A difusão de seu uso ocorreu através do desenvolvimento de métodos eficientes para visualização do produto enzimático e da aplicabilidade imediata encontrada em várias áreas de biologia. As isoenzimas têm sido utilizadas no estudo de dispersão de espécies, na análise de filogenias, no melhoramento de plantas, possibilitando a detectação de ligação gênica com caracteres mono e poligênicos, identificação de variedades, na seleção indireta de caracteres agronômicos, introgressão gênica e avaliação germoplasma.
Base genética dos marcadores isoenzimáticos: As isoenzimas desempenham a mesma atividade catalítica, mas podem ter diferentes propriedades cinéticas e ser separadas por processos bioquímicos. O número de isoenzimas de uma determinada enzima está relacionado ao número de compartimentos subcelulares onde a mesma reação catalítica é realizada (Gottlieb, 1982).
A premissa básica adotada ao se utilizar dados enzimáticos é que diferenças na mobilidade de isoenzimas em um campo elétrico são resultantes de diferenças ao nível de seqüencias de DNA que codificam tais enzimas. Assim, se os padrões de bandas de dois indivíduos diferem, assume-se que estas diferenças possuam base genética e sejam herdáveis (Murphy et al., 1990). Para interpretar os padrões de bandas resultantes, é importante ter um conhecimento prévio sobre o número de subunidades da enzima – enzimas monoméricas são formadas por um polipeptídeo, enquanto as diméricas por dois. Indivíduos heterozigotos para uma enzima dimérica, além de duas bandas correspondentes aos dois polipeptídeos, apresentam uma terceira banda intermediária, produto da conjugação dos dois polipeptídeos. É comum observar-se mais de um loco gênico em um mesmo gel, e a migração das bandas de cada loco é visualizada em zonas diferentes. As subunidades de uma enzima podem ser codificadas por locos genéticos distintos, tornando mais complexa à análise do padrão de bandas isoenzimáticas.
Detecção de marcadores isoenzimáticos: Envolve basicamente três etapas: extração de proteínas do tecido vegetal, separação destas proteínas através de eletroforese e coloração histoquímica do gel, o que permite a visualização do produto em forma de uma “banda”. Uma vez identificado o tecido, este é macerado na presença de um tampão que permita a extração das proteínas, a manutenção de sua atividade catalítica e a prevenção de oxidação de compostos fenólicos associados. O extrato é então separado em gel de eletroforese. Após a eletroforese, as isoenzimas são visualizadas através de corantes histoquímicos específicos, os quais fornecem um sub strato para as enzimas. A eletroforese é uma entre várias formas de caracterização de isoenzimas e muitas variações podem não ser detectadas por esta técnica.
Vantagens e limitações dos marcadores isoenzimáticos: Geralmente fornecem ampla informação genética para diversas aplicações, sua técnica é relativamente barata acessível. Embora em número limitado, vários locos isoenzimáticos podem ser analisados rápida e simultaneamente. Por isso, mesmo hoje, com técnicas mais modernas, as isoenzimas continuam sendo uma classe de marcadores muito útil para análises genéticas que não requeiram uma amostragem ampla do genoma. Alelos isoenzimáticos são co-dominantes, isto é, genótipos heterozigotos e homozigotos de um determinado loco são facilmente identificados, permitindo estimar parâmetros tais como frequências genotípicas e alélicas e a partir destes, coeficientes de diversidade gênica e heterozigosidade.
Porém, quando a investigação requer uma cobertura mais ampla do genoma, como no caso de mapeamento genético ou caracterização detalhada de germoplasma, as isoenzimas apresentam duas limitações básicas: o número total de locos que podem ser detectados no genoma e o número de alelos por loco, isto é, o nível de polimorfismo genético detectável em cada loco. Outras limitações das isoenzimas como marcadores dizem respeito a: modificações pós-tradução das enzimas, produzindo as “isoenzimas conformacionais”, as quais diferem em estruturas secundárias e terciárias; polimorfismo enzimático em resposta a condições ambientais; diferenças na atividade isoenzimática associadas a estágios diferentes de desenvolvimento; dentre outras.
Figura 4. Eletroforese de Isoenzimas. A identificação dos alelos isoenzimáticos em gel de eletroforese é feita através da visualização do produto (muitas vezes indiretos) da reação por eles catalisada. A enzima resulta da transcrição e tradução da informação contida na fita do DNA.