Marcadores Baseados na Amplificação de Microssatélites - AFLP
Diferentes experimentos no início dos anos 80 demonstraram que os genomas eucariotos são densamente povoados por diferentes classes de sequências repetidas, umas mais complexas e outras mais simples. Sequências simples repetidas (“SSR – Simple Sequence Repeats”, mais tarde denominadas também de “microssatélites’ (Litt & Luty, 1989) consistem de pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem.
Microssatélites têm sido observados em diversos organismos como em seres humanos, baleias, Drosophila, camundongos, bovinos e caprinos, entre outros. Em plantas, uma busca em bancos de dados de sequência de DNA publicadas revelou que os sítios de microssatélites são largamente distribuídos com uma frequência de uma a cada 50 mil pares de bases. Sua presença foi constatada em 34 espécies vegetais, sendo que o elemento repetido mais comum foi o di-nucleotídeo AT. Marcadores baseados em microssatélites estão sendo desenvolvidos para aplicações de mapeamento genético para algumas culturas de maio expressão, tais como soja, arroz e trigo.
Base genética e detecção de marcadores microssatélites: Cada “ilha” microssatélite, independente do elemento repetido (CA, TG, ATG, etc.) constitui um loco genético altamente variável, multialélico, de grande conteúdo informativo. Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco.
A detecção de sequências SSR via PCR é feita em gel de eletroforese utilizando-se poliacrilamida ou agarose especial de alta resolução, uma vez que é necessário um gel adequado para a separação de segmentos que diferem por poucos pares de bases, dependendo do número de nucleotídeos do elemento repetido no microssatélite. A visualização das bandas no gel pode ser feita diretamente por coloração com brometo de etídio, nitrato de prata ou através de autoradiografia ao se utilizar primers marcados com radioisótopos na reação de PCR. Cada loco de microssatélite é analisado ao se utilizar o para de primers construído especificamente para sua amplificação. Mais do que um loco pode ser analisado de cada vez quando os alelos de cada loco têm tamanhos suficientemente diferentes e migram para zonas separadas no gel. Nestes métodos de genotipagem denominados “multiplex”, mais do que um par de primers específicos é utilizado simultaneamente na mesma reação de PCR. Locos SSR parecem ser estáveis, possuem expressão co-dominante, ou seja, ambos os alelos de um indivíduo heterozigoto são visualizados e são altamente multialélicos, numa população onde potencialmente todos os alelos daquele loco podem ser detectados e discriminados.
Vantagens e limitações dos marcadores microssatélites: Tendo em vista a expressão co-dominante e o multialelismo, os marcadores SSR são os que possuem o mais elevado conteúdo de informação de polimorfismo na terminologia de marcadores moleculares. Por causa disso, toda e qualquer população segregante pode ser utilizada como população referência para estudos de ligação e mapeamento genético. Assim, a escolha da população para mapeamento não mais precisa ser feita com base na maximização da distância genética e sim visando à população mais informativa do ponto de vista das características biológicas ou econômicas de interesse. Os SSR são muito mais frequentes e distribuídos ao acaso, permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma eucarioto. A relevância, o nível de recursos e o número de laboratórios envolvidos fizeram com que milhares de marcadores SSR fossem desenvolvidos como parte do projeto de mapeamento do genoma humano.
Estas e outras características fazem com que marcadores baseados em SSR sejam marcadores ideais para mapeamento genético e físico de genomas, para a identificação discriminação de genótipos e estudos de genética de populações.
Porém, a maior limitação da tecnologia microssatélites é a grande quantidade de trabalho necessário para o desenvolvimento prévio dos marcadores. O protocolo de obtenção de marcadores SSR envolve resumidamente 5 passos, de acordo com a figura a seguir.
A limitação básica que existe hoje para a aplicação mais ampla desta tecnologia na análise genética e melhoramento de plantas refere-se à grande quantidade de trabalho envolvida, exigindo pessoal especializado e equipamento sofisticado para o sequenciamento automático aliado ao alto custo de um empreendimento desta natureza. Além disso, para várias espécies de plantas, principalmente de hábito alógamo, o elevado nível de diversidade genética no DNA, detectável com técnicas mais acessíveis, não justifica a magnitude do investimento necessário para o desenvolvimento de marcadores SSR.