Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição - RFLP
Por RFLP entende-se o polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA, que é evidenciado pela fragmentação do DNA através do uso de enzimas de restrição e observado por hibridização destes fragmentos com sequências homólogas de DNA marcadas com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reação de luminescência. Para que o polimorfismo seja detectado, é necessário que as sequências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivíduos comparados sejam distintas.
Há 25 anos os marcadores RFLP foram estudados pela primeira vez em um experimento destinado à detectação de mutações em DNA de vírus (Grodzicker et al., 1974). Em pouco tempo estes marcadores tornaram-se ferramenta importante em várias áreas de biologia e têm sido utilizados para aprofundar o conhecimento de diferentes temas biológicos.
Base genética dos marcadores RFLP: O polimorfismo observado na técnica de RFLP ocorre porque o DNA de indivíduos geneticamente distinto difere na sequência de nucleotídeos ao longo da fita. A presença ou ausência de sequências específicas de 4 a 8 pares de bases, reconhecidas e clivadas pelas enzimas de restrição, pode variar entre diferentes indivíduos, gerando polimorfismo. Ao ser submetido à clivagem com uma enzima de restrição, o DNA de indivíduos geneticamente distintos é cortado nos sítios de restrição, gerando fragmentos de diferentes tamanhos. A base genética do polimorfismo observado resulta de mutações nos sítios de restrição, deleções e rearranjos entre os sítios.
Obtenção de sondas para detecção dos marcadores RFLP: Os clones a serem utilizados como sondas podem ser obtidas de diferentes formas, as mais comuns sendo: através da transcrição reversa de mRNA do organismo em estudo, produzindo-se uma biblioteca de moléculas de DNA complementar (“cDNA library”); de fragmento de DNA genômico clonados ao acaso (“genomic library”); da amplificação via PCR de sequências conhecidas utilizando primers específicos; e por fim, através de bandas RAPD selecionadas e obtidas de gel de eletroforese, e amplificadas via PCR.
Depois de obtida a coleção de clones, faz-se uma seleção daqueles que serão utilizados como sondas, o objetivo deste processo, é selecionar clones que possuam cópia única, ou seja, que não contenham sequência de DNA repetitivo, pois estes hibridizam com vários fragmentos na membrana, o que resulta em borrões não interpretáveis em padrões de bandas múltiplas difíceis de acompanhar do ponto de vista de distinção de locos, alelos e segregação Mendeliana.
Vantagens e limitações dos marcadores RFLP: Comparados às isoenzimas, os marcadores RFLP possuem a vantagem de cobrir todo o genoma do organismo estudado. Possuem expressão co-dominante, isto é, em cada loco estudado é possível identificar genótipos hetero e homozigotos, gerando mais informações e permitindo uma análise detalhada da ação gênica e da interação entre os alelos. Ao contrário das isoenzimas, o número de marcadores RFLP é praticamente ilimitado, e o nível de polimorfismo alélico em cada loco é muito maior. Outra característica de marcadores de DNA em relação à isoenzimas é a alta estabilidade do DNA, que pode ser extraído, conservado e reutilizado por longos períodos de tempo. As membranas de hibridização também podem ser conservadas e reutilizadas por 15 ou mais vezes, o que assegura que o processo de obtenção das mesmas seja compensado por seu prolongado uso.
Sabendo que a maioria dos experimentos de melhoramento genético envolve a análise de centenas de indivíduos para vários locos marcadores, é fundamental que a técnica de marcadores moleculares utilizada seja eficiente na geração de dados e possa, em algum tempo ser automatizada. A técnica de RFLP apresenta uma série de limitações neste aspecto, uma vez que envolve vários passos intensivos em mão de obra. Outra limitação que se apresenta ao se iniciar um projeto é a inexistência de uma. Frequentemente, ao se iniciar um projeto não há uma biblioteca de sondas disponível, esta, portanto, deverá ser obtido em outro laboratório, o que leva vários meses. O uso de RFLP requer um pessoal técnico habilitado para a manipulação de DNA recombinante, neste aspecto é uma técnica mais complexa do que a isoenzimas. Estes aspectos têm tornado limitado o uso do RFLP.
Figura 5. Autoradiografia de uma membrana de hibridização revelando marcadores RFLP. Indivíduos homozigotos para alelos A1(3, 5, 6, 7, 8,9) e Homozigotos para os alelos A2 (1, 2,4) de um loco RFLP são identificados.